Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 15La baicalina allevia lo stress ossidativo e l'infiammazione nella nefropatia diabetica tramite la via di segnalazione Nrf2 e MAPKAutori Ma L, Wu F, Shao Q, Chen G, Xu L, Lu FPubblicato il 21 luglio 2021 Volume 2021:15 Pagine 3207—3221DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S319260Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Georgios D. PanosLeyi Ma,1,* Fan Wu,1,* Qingqing Shao,1 Guang Chen,2 Lijun Xu,1 Fuer Lu1 1Istituto di Medicina Tradizionale Integrata Cinese e Occidentale, Ospedale Tongji, Tongji Medical College, Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong, Wuhan , 430030, Repubblica popolare cinese;2Dipartimento di Medicina Integrata Cinese Tradizionale e Occidentale, Ospedale Tongji, Tongji Medical College, Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong, Wuhan, 430030, Repubblica Popolare Cinese *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Corrispondenza: Fuer Lu Email [email protected] Background: Lo stress ossidativo e l'infiammazione svolgono ruoli essenziali nello sviluppo e nella progressione della nefropatia diabetica (DN).Baicalin (BAI), un flavonoide naturale, ha dimostrato di avere un effetto renoprotettivo in varie malattie renali.Tuttavia, i suoi meccanismi sottostanti in DN rimangono poco chiari.In questo studio, abbiamo esplorato i potenziali effetti e i meccanismi sottostanti di BAI su DN utilizzando un modello DN spontaneo.Metodi: Gli effetti protettivi del BAI sul DN sono stati valutati rilevando indicatori biochimici correlati al DN, istopatologia renale e apoptosi cellulare.Successivamente, abbiamo esaminato il livello di stress ossidativo renale e di infiammazione per spiegare gli effetti renoprotettivi del BAI.Quindi, il percorso Nrf2 è stato testato per chiarire la sua attività antiossidante ed è stata condotta la trascrittomica renale per chiarire la sua attività antinfiammatoria.Infine, è stato applicato il Western blot per la verifica finale del meccanismo.RISULTATI: I nostri risultati hanno scoperto che BAI migliorava efficacemente le condizioni diabetiche, la proteinuria, i cambiamenti istopatologici renali e l'apoptosi cellulare nel DN.BAI ha migliorato significativamente i livelli renali di glutatione perossidasi (GSH-PX), superossido dismutasi (SOD) e catalasi (CAT) e ha ridotto il livello di malondialdeide (MDA).Nel frattempo, l'infiltrazione di cellule infiammatorie inclusi linfociti T, cellule T-helper, neutrofili e macrofagi e anche i livelli di mRNA delle citochine pro-infiammatorie (IL-1β, IL-6, MCP-1 e TNFα) sono stati ovviamente inibiti da BAI.Successivamente, Western blot ha scoperto che BAI attivava significativamente la segnalazione Nrf2 e aumentava l'espressione degli enzimi antiossidanti a valle (HO-1, NQO-1).La trascrittomica renale ha rivelato che l'inibizione della via di segnalazione MAPK può contribuire all'attività antinfiammatoria del BAI, che è stata verificata anche in esperimenti successivi.Il trattamento con BAI ha ovviamente inibito l'attivazione della famiglia MAPK della via di segnalazione pro-infiammatoria canonica, come Erk1/2, JNK e P38.Conclusione: In sintesi, i nostri dati hanno dimostrato che BAI può trattare il DN alleviando lo stress ossidativo e l'infiammazione e i suoi meccanismi sottostanti erano associati all'attivazione della via di segnalazione antiossidante mediata da Nrf2 e all'inibizione della via di segnalazione infiammatoria mediata da MAPK.Parole chiave: baicalin, nefropatia diabetica, stress ossidativo, infiammazione, Nrf2, MAPKLa nefropatia diabetica (DN) è una delle principali complicanze microvascolari del diabete, che ha superato la glomerulonefrite come causa primaria di malattia renale cronica (CKD) in Cina.1,2 È stato riportato che oltre il 15-40% dei pazienti con diabete mellito ( DM) possono sviluppare DN durante la loro vita,3 e una parte di loro alla fine progredisce verso la malattia renale allo stadio terminale (ESRD).Attualmente non esiste un approccio soddisfacente per la prevenzione e il trattamento della DN.Sebbene il controllo glicemico stretto e il controllo della pressione sanguigna si siano dimostrati efficaci, molti pazienti in trattamento con ipoglicemizzanti orali combinati con inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACEI) o bloccanti del recettore dell'angiotensina (ARB) continuano a progredire verso ESRD e il tasso di sopravvivenza dei pazienti inoltre non presenta miglioramenti significativi a causa dell'efficacia limitata e di alcuni effetti collaterali.2,4 Pertanto, lo sviluppo di nuovi agenti è di grande valore nel trattamento del DN.Le caratteristiche patologiche tipiche del DN, inclusi il danno delle cellule epiteliali tubulari, la sclerosi glomerulare, l'apoptosi, l'infiltrazione infiammatoria e la fibrosi interstiziale renale.5 Ad oggi, la patogenesi del DN rimane poco chiara.Numerose evidenze hanno suggerito che lo stress ossidativo e l'infiammazione giocano un ruolo chiave nello sviluppo del DN.6–8 Meccanicamente, l'iperglicemia cronica nei pazienti con DM è considerata un fattore scatenante per avviare la cascata a valle.9 In breve, l'iperglicemia può indurre l'eccessiva produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che porta invariabilmente a stress ossidativo.Quindi, lo stress ossidativo provoca una serie di disturbi metabolici e cellulari, tra cui la perossidazione lipidica, l'ossidazione delle proteine ​​e il danno al DNA, che alla fine portano alla morte cellulare.10 Inoltre, lo stress ossidativo può anche promuovere la risposta infiammatoria stimolando la generazione di fattori di crescita correlati, le citochine e fattori di trascrizione.11 Allo stesso modo, nei pazienti diabetici, l'iperglicemia persistente può anche indurre direttamente uno stato infiammatorio cronico di basso grado poiché il diabete è già stato ben riconosciuto come un'infiammazione metabolica.12 Lo stress infiammatorio cronico locale non solo causa direttamente danni agli organi e morte cellulare ma compromette anche i sistemi di difesa antiossidanti, aggravando così il circolo vizioso sopra menzionato.13,14 Nel loro insieme, c'è una diafonia tra stress ossidativo e infiammazione nella progressione del DN.Lo stress ossidativo e l'infiammazione mediati dall'iperglicemia si influenzano e si promuovono a vicenda e di concerto contribuiscono alla progressione della malattia.15 Nel trattamento del DN, lo stress ossidativo o le terapie antinfiammatorie sono state ampiamente studiate e hanno dimostrato di avere determinati effetti.16, 17 Dato che, rispetto alle singole terapie anti-stress ossidative o anti-infiammatorie, la strategia mirata a più vie (antiossidativa e antinfiammatoria) può esercitare una migliore efficacia e ha riscosso un notevole interesse.Baicalin (BAI), uno dei principali flavonoidi bioattivi dalla radice della pianta medicinale Scutellaria baicalensis Georgi (S. baicalensis), che ha dimostrato di possedere vari effetti farmacologici, come proprietà antidiabetiche, antiossidanti, antinfiammatorie e antitumorali .18–20 Gli studi hanno dimostrato che la BAI può proteggere dal DN inibendo la fibrosi renale progressiva e i relativi meccanismi sono stati associati all'inibizione della segnalazione di NF-κB.21–23 Poiché la fibrosi d'organo è il risultato di stress cronico e si verifica sempre in nelle fasi intermedie e tardive delle malattie croniche, la fibrogenesi potrebbe non essere il principale promotore nella fase iniziale del DN.24 Tuttavia, gli studi attuali sulla BAI sul DN si sono concentrati principalmente sulla fibrosi renale, sono state condotte poche ricerche per esplorare gli effetti del BAI sugli eventi a monte in DN: stress ossidativo e infiammazione.È interessante notare che un recente studio clinico ha studiato gli effetti della baicalina sui pazienti con DN ed è stato scoperto che la BAI migliora la funzione renale e ritarda la progressione della malattia nei pazienti con DN attraverso vie antinfiammatorie e antiossidanti.25 Tuttavia, ulteriori indagini approfondite su mancano ancora gli animali modello.Sulla base dello stress ossidativo e dell'infiammazione, il chiarimento dei meccanismi alla base degli effetti protettivi del BAI sul DN è significativo per lo sviluppo di nuovi agenti.Detto questo, abbiamo ipotizzato che BAI potrebbe prevenire il DN alleviando lo stress ossidativo e l'infiammazione.Al fine di verificare la nostra ipotesi, abbiamo condotto esperimenti in vivo per valutare gli effetti del BAI sul DN.Successivamente, sono stati determinati i livelli di stress ossidativo e di infiammazione per spiegare la proprietà renoprotettiva del BAI.Infine, sono state verificate diverse vie di segnalazione cruciali per chiarire i meccanismi molecolari sottostanti.I nostri risultati fanno luce sul BAI come potenziale prodotto naturale che prende di mira lo stress ossidativo e l'infiammazione per il trattamento del DN.Baicalin è stato ottenuto da Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, Cina) ed è stato risospeso utilizzando acqua distillata a 40 mg/mL per gli esperimenti sugli animali.Anticorpi contro P38, Bax, Bcl-2, Caspase-3, Erk1/2, Nrf2, HO-1 e β-action sono stati acquistati da Proteintech (Wuhan, Cina).JNK, p-JNK e tutti gli anticorpi secondari utilizzati nel Western blot sono stati ottenuti da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).Gli anticorpi p-P38, p-Erk1/2, NQO-1, CD3 e MPO provenivano da ABclonal Technology (Wuhan, Cina).L'anticorpo CD68 è stato fornito da Abcam (Cambridge, MA).L'anticorpo CD4 è stato ottenuto da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).Trizol, Hifair™ II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix e Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix provenivano da Yeasen (Shanghai, Cina).I kit di apoptosi e immunoistochimica TUNEL sono stati ottenuti da Wuhan Gugeshengwu Technology Co., Ltd. (Wuhan, Cina).Tutti gli altri reagenti regolari sono stati ottenuti da Wuhan Gugeshengwu Technology Co., Ltd. se non diversamente specificato.L'esperimento sugli animali è stato supervisionato e approvato dall'Animal Ethics Committee dell'ospedale Tongji del Tongji Medical College dell'Università di scienza e tecnologia di Huazhong (HUST) secondo le Linee guida per la revisione etica del benessere degli animali (GB/T 35892–2018).I topi maschi db/db e db/m di sette settimane sono stati forniti dall'Istituto di ricerca biomedica di Nanchino dell'Università di Nanchino e alloggiati nel centro sperimentale per animali (grado SPF) in condizioni di ciclo buio/luce di 12 ore, 60 ± 5% umidità relativa e temperatura ambiente di 20 ± 2 °C.Dopo una settimana di acclimatamento, i topi db/db sono stati divisi casualmente in due gruppi: gruppo modello (n=8) e gruppo BAI (400 mg/kg, n=8), mentre i topi db/m sono stati assegnati come gruppo di controllo (n =8).Nei gruppi di controllo e modello, i topi sono stati somministrati giornalmente (10 ml/kg di peso corporeo) con acqua distillata e nel gruppo BAI i topi sono stati somministrati giornalmente con una sospensione di BAI (40 mg/ml) nella stessa dose.Poiché i flavonoidi naturali hanno caratteristiche comuni di bassa biodisponibilità orale, la dose è stata scelta sulla base di studi precedenti per garantirne l'efficacia.26,27 Il trattamento farmacologico è durato per le successive 8 settimane fino alla fine di questo studio.Il protocollo sperimentale è illustrato nella Figura 1A.Durante lo studio, il peso corporeo è stato misurato ogni tre giorni e la glicemia a digiuno (FBG) è stata misurata settimanalmente.Alla fine dell'esperimento, tutti i topi sono stati anestetizzati con pentobarbital all'1% (65 μL/10 g, ip).Dopo aver raccolto il campione di sangue, i topi sono stati sottoposti a eutanasia con CO2.Figura 1 La somministrazione di BAI migliora significativamente le condizioni diabetiche nei topi db/db.(A) Protocollo sperimentale sugli animali di questo studio.(B) Il peso corporeo dei topi è stato registrato ogni 3 giorni durante l'esperimento.(n=8) (C) La glicemia a digiuno dei topi è stata registrata settimanalmente durante l'esperimento.(n=8) (D) L'indice HOMA-IR è stato calcolato secondo la formula standard: HOMA-IR= FBG (mM) × insulina a digiuno (mU/L)/22,5.( n = 8) (E) Per GTT, i topi sono stati a digiuno durante la notte e iniettati per via intraperitoneale con glucosio (ip, 0,75 g/kg), la glicemia è stata misurata a 0, 15, 30, 60 e 120 minuti dopo la somministrazione di glucosio;il grafico a barre rappresenta l'area media sotto la curva.( n = 6) (F) Per ITT, i topi sono stati a digiuno durante la notte e iniettati per via intraperitoneale con insulina (ip, 1,0 U/kg), la glicemia è stata misurata a 0, 15, 30, 60 e 120 minuti dopo la somministrazione di insulina;il grafico a barre rappresenta l'area media sotto la curva.(n=6) Tutti i dati sono presentati come medie ± DS.*p <0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.Figura 1 La somministrazione di BAI migliora significativamente le condizioni diabetiche nei topi db/db.(A) Protocollo sperimentale sugli animali di questo studio.(B) Il peso corporeo dei topi è stato registrato ogni 3 giorni durante l'esperimento.(n=8) (C) La glicemia a digiuno dei topi è stata registrata settimanalmente durante l'esperimento.(n=8) (D) L'indice HOMA-IR è stato calcolato secondo la formula standard: HOMA-IR= FBG (mM) × insulina a digiuno (mU/L)/22,5.( n = 8) (E) Per GTT, i topi sono stati a digiuno durante la notte e iniettati per via intraperitoneale con glucosio (ip, 0,75 g/kg), la glicemia è stata misurata a 0, 15, 30, 60 e 120 minuti dopo la somministrazione di glucosio;il grafico a barre rappresenta l'area media sotto la curva.( n = 6) (F) Per ITT, i topi sono stati a digiuno durante la notte e iniettati per via intraperitoneale con insulina (ip, 1,0 U/kg), la glicemia è stata misurata a 0, 15, 30, 60 e 120 minuti dopo la somministrazione di insulina;il grafico a barre rappresenta l'area media sotto la curva.(n=6) Tutti i dati sono presentati come medie ± DS.*p <0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.Durante l'ultima settimana dello studio sono stati condotti test di tolleranza al glucosio e all'insulina.In breve, tutti i topi sono stati lasciati a digiuno durante la notte e iniettati per via intraperitoneale con glucosio (ip, 0,75 g/kg) per il test di tolleranza al glucosio (GTT).Per il test di tolleranza all'insulina (ITT), i topi sono stati a digiuno 6 ore e iniettati per via intraperitoneale con insulina (ip, 1,0 U/kg).La glicemia della vena caudale è stata misurata a 0, 15, 30, 60 e 120 minuti dopo la somministrazione di glucosio o insulina mediante strip di glucosio (ACCU-CHEK Performa, Roche).Dopo aver raccolto il campione di sangue, i livelli sierici di insulina sono stati determinati dal kit ELISA (Bioswamp Life Science Lab, Wuhan, Cina) seguendo il protocollo del produttore.L'indice di resistenza all'insulina (HOMA-IR) per la valutazione del modello di omeostasi è stato calcolato secondo la seguente formula:.Nell'ultima settimana di trattamento farmacologico, campioni di urina di topo delle 24 ore sono stati raccolti individualmente utilizzando gabbie metaboliche.Successivamente, i livelli di albumina nelle urine sono stati misurati con il kit ELISA (Bioswamp Life Science Lab, Wuhan, Cina).La creatinina urinaria e sierica e l'azoto ureico sierico (BUN) sono stati determinati dai kit di analisi della creatinina (Cr) e dell'urea (Istituto di bioingegneria di Nanchino Jiancheng, Nanchino, Cina) secondo le istruzioni del produttore corrispondente.Il tasso di escrezione dell'albumina urinaria (AER) è stato calcolato secondo la seguente formula: AER (μg/24 h) = albumina urinaria (μg/mL) × volume di urina delle 24 ore (mL/24 h).Il rapporto albumina urinaria/creatinina (ACR) è stato calcolato secondo la seguente formula:.Il tasso di clearance della creatinina (Ccr) è stato calcolato secondo la seguente formula:I vetrini renali inclusi in paraffina sono stati colorati con acido periodico Schiff (PAS) secondo il protocollo standard per l'analisi istologica.In primo luogo, le immagini dei reni sono state acquisite da un sistema Olympus BX51 (Olympus, Giappone).Quindi, le immagini sono state scansionate e le aree del profilo sono state tracciate utilizzando l'immagine J. L'area glomerulare è stata calcolata in base all'area media di 10 glomeruli in ciascun gruppo e la frazione mesangiale è stata definita come un rapporto tra l'area PAS-positiva e quella priva di nuclei rispetto a Area PAS-positiva (compresa l'area dei nuclei).Per scoprire i cambiamenti dell'ultrastruttura nel glomerulo, è stata applicata anche la microscopia elettronica a trasmissione e scansione (Hitachi, Tokyo, Giappone) per l'osservazione dell'istopatologia dell'ultrastruttura.Campioni di reni congelati sono stati omogeneizzati in PBS e il surnatante di omogenati di tessuto è stato impiegato per stimare gli indicatori di stress ossidativo.I kit di analisi della glutatione perossidasi (GSH-PX), della superossido dismutasi (SOD), della catalasi (CAT) e della malondialdeide (MDA) sono stati ottenuti dal Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina).Questi indicatori biochimici sono stati esaminati secondo le istruzioni.I vetrini inclusi in paraffina sono stati decerati con dimetilbenzene, polarizzati con concentrazioni decrescenti di alcol e risciacquati con acqua deionizzata.L'attività della perossidasi endogena è stata bloccata incubando i vetrini in H2O2 al 3% a temperatura ambiente per 30 minuti dopo il recupero dell'antigene.Il siero di capra normale al 20% è stato utilizzato per bloccare i vetrini per 1 ora.Gli anticorpi primari sono stati applicati durante la notte a 4 ° C, seguiti dall'incubazione dell'anticorpo secondario coniugato con HRP per 60 minuti a temperatura ambiente.I vetrini sono stati visualizzati mediante DAB e colorati di contrasto con ematossilina.Le immagini sono state scattate da un sistema Olympus BX51 e analizzate dal software Image J (National Institutes of Health, USA).Secondo il protocollo del produttore, i vetrini renali sono stati utilizzati per il kit per apoptosi TUNEL (Gugeshengwu Technology, Wuhan, Cina).Un sistema Olympus BX51 (Olympus, Giappone) è stato utilizzato per osservare le cellule TUNEL-positive.L'analisi trascrittomica è stata condotta da Seqhealth Technology Co., LTD (Wuhan, Cina).L'RNA totale del tessuto renale fresco è stato isolato utilizzando il reagente Trizol.La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state determinate dallo spettrofotometro Nanodrop™ OneC (Thermo Fisher Scientific Inc., USA).L'integrità dell'RNA è stata testata mediante elettroforesi su gel di agarosio all'1,0%.Sono stati utilizzati due microgrammi di RNA totali per la preparazione della libreria di sequenziamento dell'RNA a filamento utilizzando il kit di preparazione della libreria di mRNA a filamento KC-DigitalTM per Illumina® (Catalogo n. DR08502, Wuhan Seqhealth Co., Ltd. Cina) seguendo le istruzioni del produttore.Dopo la costruzione della libreria di cDNA, la concentrazione e la qualità delle librerie sono state valutate mediante Qubit 2.0 (Life Technologies, USA) ed elettroforesi su gel di agarosio.Successivamente, i prodotti da 200 a 500 bp sono stati arricchiti, quantificati e infine sequenziati nel sistema HiSeq X10 (Illumina, San Diego, CA, USA).Per l'analisi dei dati RNA-seq, i dati grezzi sono stati prima filtrati dal software Trimmomatic (versione: 0.36) in cui le letture di bassa qualità sono state scartate e le sequenze dell'adattatore sono state tagliate.Le letture pulite di ciascun campione sono state mappate sul genoma di riferimento del mouse GRCm38 utilizzando il programma Star (2.3.0).Per giudicare la significatività statistica dei geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati utilizzati un cutoff del valore P corretto di 0,05 e un cutoff del cambiamento di piega di 1.L'analisi dell'arricchimento dell'ontologia genica (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dei DEG è stata condotta utilizzando il database Metascape.L'RNA tissutale è stato estratto utilizzando il reagente Trizol secondo il protocollo standard.Dopo la trascrizione inversa, RT-qPCR è stata eseguita sul sistema LightCycler®96 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania).Il livello di mRNA dei geni bersaglio è stato normalizzato e analizzato con il metodo 2-ΔΔCT.Le sequenze dei primer utilizzati in questo studio sono elencate nella Tabella 1.Tabella 1 Primer utilizzati per RT-qPCRTabella 1 Primer utilizzati per RT-qPCRLe proteine ​​totali sono state estratte dal tampone RIPA integrato con l'1% di PMSF e il cocktail di inibitore della proteasi ha seguito il protocollo standard, quindi le concentrazioni proteiche sono state quantificate utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​​​dell'acido bicinconinico (BCA).Uguali quantità di estratti proteici sono state caricate su SDS-PAGE (80 V, 0,5 h e poi 120 V, 1 h) ed elettrotrasferite su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 μm o su una membrana PVDF da 0,22 μm (280 mA, 1 kDa/min).Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente e incubate con anticorpi primari per una notte a 4°C.Il giorno successivo, gli anticorpi secondari coniugati con fluorescenza sono stati applicati alle membrane per 1 ora a temperatura ambiente.Le membrane sono state visualizzate con Odyssey Infrared Imaging (LI-COR Biosciences, USA).Le proteine ​​​​bersaglio sono state normalizzate in β-actina e quantificate dal software Image J.Le analisi statistiche sono state eseguite seguendo questa regola: in primo luogo, la normalità dei dati viene verificata dal grafico QQ insieme al test Shapiro-Wilk;In secondo luogo, il test ANOVA con l'analisi post-hoc di Tukey è stato utilizzato per i dati che seguono la distribuzione normale e il test di Kruskal-Wallis con il test post-hoc di Dunn per i dati distorti (che non obbediscono alla distribuzione normale).I dati che si adattano alla distribuzione normale sono presentati come media ± DS e i dati distorti sono presentati come mediana (min-max).Le statistiche sono state analizzate utilizzando GraphPad Prism 8.0 e SPSS 24.0 e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.In questo lavoro, i topi db/db sono stati usati come modello DN spontaneo.In primo luogo, abbiamo esaminato gli indicatori diabetici in trattamento con BAI.Come mostrato nella Figura 1B, la somministrazione di BAI ha ovviamente impedito l'aumento di peso rispetto al gruppo modello alla fine dell'esperimento (gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,022).Rispetto al gruppo di controllo, la glicemia a digiuno (FBG) del gruppo modello era notevolmente elevata, mentre la somministrazione di BAI ha ridotto significativamente l'FBG (gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,013) (Figura 1C).Dopo aver raccolto i campioni, è stato rilevato anche il livello di insulina a digiuno.È stato riscontrato che il modello e i gruppi BAI mostravano tutti un aumento reattivo del livello di insulina rispetto al gruppo di controllo, ma non vi era alcuna differenza nel livello di insulina a digiuno tra il modello e il gruppo BAI (gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,7637) (Figura 1 supplementare).Questo risultato ha indicato che BAI potrebbe non avere effetti sulla secrezione di insulina.A causa del miglioramento delle condizioni FBG, l'indice di resistenza all'insulina (HOMA-IR) per la valutazione del modello di omeostasi era ancora ridotto dalla somministrazione di BAI rispetto al gruppo modello (gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,0256) (Figura 1D).Inoltre, lo stato del metabolismo del glucosio è stato valutato anche mediante test di tolleranza al glucosio e all'insulina.Coerentemente con i risultati di cui sopra, la somministrazione di BAI può aumentare il tasso di clearance del glucosio e migliorare la sensibilità all'insulina (GTT: gruppo di controllo vs gruppo modello p < 0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,0034; ITT: gruppo di controllo vs gruppo modello p < 0,001, BAI gruppo vs gruppo modello p = 0,0114) (Figura 1E e F).Sebbene i topi db/db trattati con BAI siano ancora lontani dai topi normali in termini di stato di diabete, ma rispetto al gruppo BAI con i topi modello, era evidente che la somministrazione di BAI migliora significativamente le condizioni diabetiche nei topi db/db.Pertanto, non c'è dubbio che BAI possieda un effetto antidiabetico.Presi insieme, tutti questi dati hanno dimostrato che la somministrazione di BAI migliora significativamente le condizioni diabetiche nei topi db/db.In condizioni normali, i topi db/db svilupperanno spontaneamente nel tempo un danno renale diabetico.Sulla base di ciò, abbiamo ulteriormente studiato gli effetti protettivi del BAI sulla funzione renale esaminando vari indicatori biochimici.Rispetto al gruppo di controllo, i topi del gruppo modello hanno mostrato un tipico sintomo di microalbuminuria (Figura 2A), che ha anche suggerito che il nostro modello DN ha successo.Il trattamento con BAI ha ridotto significativamente il livello di albumina nelle urine, il rapporto albumina/creatinina (ACR) e il tasso di escrezione di albumina nelle urine (AER) rispetto al gruppo modello (albumina urinaria: gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p <0,001; ACR: gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,0021; AER: gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p <0,001) (Figura 2A).Rispetto al gruppo di controllo, anche il volume di urina delle 24 ore nel modello e nel gruppo BAI erano ovviamente aumentati, in cui la somministrazione di BAI ha portato a un trend di riduzione del volume di urina sebbene non fosse statisticamente significativo (gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo di modelli p = 0,3624) (Figura 2 supplementare).Inoltre, abbiamo scoperto che non vi era alcuna differenza nell'azoto ureico sierico (BUN), nella creatinina sierica e nel tasso di clearance della creatinina (Ccr) tra i diversi gruppi (BUN: gruppo di controllo vs gruppo modello p = 0,1334, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,5229; Scr: gruppo di controllo vs gruppo modello p = 0,1289, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,7232; Ccr: gruppo di controllo vs gruppo modello p = 0,7153, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,9914) (Figura 2 supplementare).Questo fenomeno era nelle nostre aspettative.In questo studio, il motivo per cui abbiamo impiegato un tempo di intervento relativamente breve è stato quello di realizzare topi DM con proteinuria tipica ma non disfunzione renale (stadio iniziale di DN).Questi risultati hanno indicato che il BAI può esercitare un effetto evidente nel ridurre la proteinuria.Figura 2 La somministrazione di BAI riduce la proteinuria e migliora i cambiamenti istopatologici nel DN.(A) Il livello di albumina nelle urine, il rapporto albumina/creatinina nelle urine (ACR) e il tasso di escrezione di albumina nelle urine (AER) di diversi gruppi.(n=8) (B) Immagini renali di diversi gruppi.Barra della scala, 1 cm (n=8) (C) Peso del rene di diversi gruppi.(n = 8) (D) Colorazione rappresentativa del PAS del rene di diversi gruppi.Barra della scala, 50 μm.(n=8) (E) Area glomerulare e frazione mesangiale di diversi gruppi.( n = 8) (F) Immagini SEM rappresentative del rene di diversi gruppi.Barra della scala, 2 μm.( n = 8) (G) Immagini rappresentative del rene TEM di diversi gruppi.Barra della scala, 1 μm.(n=8) Tutti i dati sono presentati come medie ± DS.*p <0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.Figura 2 La somministrazione di BAI riduce la proteinuria e migliora i cambiamenti istopatologici nel DN.(A) Il livello di albumina nelle urine, il rapporto albumina/creatinina nelle urine (ACR) e il tasso di escrezione di albumina nelle urine (AER) di diversi gruppi.(n=8) (B) Immagini renali di diversi gruppi.Barra della scala, 1 cm (n=8) (C) Peso del rene di diversi gruppi.(n = 8) (D) Colorazione rappresentativa del PAS del rene di diversi gruppi.Barra della scala, 50 μm.(n=8) (E) Area glomerulare e frazione mesangiale di diversi gruppi.( n = 8) (F) Immagini SEM rappresentative del rene di diversi gruppi.Barra della scala, 2 μm.( n = 8) (G) Immagini rappresentative del rene TEM di diversi gruppi.Barra della scala, 1 μm.(n=8) Tutti i dati sono presentati come medie ± DS.*p <0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.Morfologicamente, la dimensione del rene e il peso del gruppo modello erano apparentemente maggiori di quelli del gruppo di controllo e il trattamento con BAI ha ridotto le dimensioni e il peso del rene nei topi modello (gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,0375) ( Figure 2B e C).Tuttavia, è stato riscontrato che gli indici renali (rapporto peso del rene/peso corporeo) del modello e dei gruppi BAI erano tutti inferiori a quelli del gruppo di controllo e non vi era alcuna differenza tra questi due gruppi (gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, BAI gruppo vs gruppo modello p = 0,8462) (Figura 3 supplementare).Questo risultato era anche correlato al nostro primo modello DN.Oltre alla proteinuria persistente, anche le alterazioni istopatologiche come l'ipertrofia glomerulare, l'espansione della matrice mesangiale, l'ispessimento della membrana basale glomerulare (GBM) e il danno podocitario sono le caratteristiche importanti del DN.L'analisi istologica della colorazione PAS ha mostrato che BAI attenuava significativamente l'ipertrofia glomerulare e l'espansione della matrice mesangiale rispetto al gruppo modello (area glomerulare: gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p <0,001; Frazione mesangiale: gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p <0,001) (Figura 2D ed E).Le immagini di microscopia elettronica a scansione e trasmissione (SEM e TEM) hanno mostrato cambiamenti istologici significativi, come distacco dei podociti, cancellazione del processo del piede e ispessimento GBM nei topi DN, che sono stati ovviamente invertiti dal trattamento BAI (Figura 2F e G).Collettivamente, i nostri dati hanno suggerito che BAI può ridurre la proteinuria e migliorare i cambiamenti istopatologici nei topi DN.È stato dimostrato che l'apoptosi cellulare svolge un ruolo chiave nello sviluppo e nella progressione del DN.28 Nel DN, l'apoptosi può essere innescata da vari fattori, tra cui l'iperglicemia, lo stress ossidativo e l'infiammazione, e può verificarsi in più tipi di cellule, come il tubolare cellule epiteliali, cellule endoteliali e interstiziali.29 Al fine di determinare se BAI potrebbe influenzare l'apoptosi cellulare in DN, la colorazione terminale deossinucleotidil transferasi dUTP nick end labelling (TUNEL) è stata utilizzata per osservare le cellule apoptotiche.I risultati della colorazione TUNEL hanno rivelato che il livello di apoptosi del gruppo modello era significativamente indotto rispetto a quello del gruppo di controllo (area verde) e la somministrazione di BAI ha soppresso l'eccessiva apoptosi cellulare rispetto al gruppo modello (Figura 3A).Nel frattempo, abbiamo esaminato i livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate all'apoptosi, inclusi Bax, Bcl-2 e caspasi-3 scissa.Coerentemente, il gruppo modello ha mostrato una maggiore espressione di proteine ​​​​pro-apoptotiche, Bax e cleaved caspase-3, e una ridotta espressione della proteina anti-apoptotica, Bcl-2, che è stata invertita dalla somministrazione di BAI (Cleaved caspase-3: gruppo di controllo vs gruppo modello p < 0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p < 0,001; Bax: gruppo di controllo vs gruppo modello p < 0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p < 0,001; Bcl-2: gruppo di controllo vs gruppo modello p < 0,001, gruppo BAI vs modello gruppo p < 0,001) (Figura 3B e C).Insieme, questi dati hanno suggerito che la somministrazione di BAI può sopprimere l'apoptosi cellulare in DN.Figura 3 La somministrazione di BAI sopprime l'apoptosi cellulare in DN.(A) Rappresentazione della colorazione TUNEL del rene di diversi gruppi.Barra della scala, 50 μm.(n = 6) (B) Western blot rappresentativi per le espressioni proteiche di caspase-3, caspase-3, Bax e Bcl-2 negli estratti di tessuto renale.(n = 6) (C) La quantificazione delle Western blot della proteina scissa-3, Bax e Bcl-2.Tutti i dati sono presentati come medie ± SD.***p < 0,001.Figura 3 La somministrazione di BAI sopprime l'apoptosi cellulare in DN.(A) Rappresentazione della colorazione TUNEL del rene di diversi gruppi.Barra della scala, 50 μm.(n = 6) (B) Western blot rappresentativi per le espressioni proteiche di caspase-3, caspase-3, Bax e Bcl-2 negli estratti di tessuto renale.(n = 6) (C) La quantificazione delle Western blot della proteina scissa-3, Bax e Bcl-2.Tutti i dati sono presentati come medie ± SD.***p < 0,001.Per valutare gli effetti della BAI sullo stress ossidativo, abbiamo testato i livelli renali degli indicatori di stress ossidativo, tra cui glutatione perossidasi (GSH-PX), superossido dismutasi (SOD), catalasi (CAT) e malondialdeide (MDA).Come mostrato nella Figura 4, rispetto al gruppo modello, i livelli di GSH-PX, SOD e CAT sono stati significativamente migliorati e il livello di MDA è stato significativamente ridotto nel gruppo BAI (SOD: gruppo di controllo vs gruppo modello p = 0,006, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,0438; GSH-PX: gruppo di controllo vs gruppo modello p = 0,0071, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,0259; CAT: gruppo di controllo vs gruppo modello p <0,001, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,0197; MDA : gruppo di controllo vs gruppo modello p = 0,0034, gruppo BAI vs gruppo modello p = 0,032).Questi risultati hanno dimostrato che la somministrazione di BAI può alleviare il danno da stress ossidativo migliorando le attività degli enzimi antiossidanti.Figura 4 La somministrazione di baicalin allevia lo stress ossidativo nel DN.I livelli di SOD, GSH-PX, CAT e MDA negli estratti di tessuto renale di diversi gruppi.(n=6) Tutti i dati sono presentati come medie ± DS.*p <0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.Figura 4 La somministrazione di baicalin allevia lo stress ossidativo nel DN.I livelli di SOD, GSH-PX, CAT e MDA negli estratti di tessuto renale di diversi gruppi.(n=6) Tutti i dati sono presentati come medie ± DS.*p <0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.Successivamente, abbiamo studiato gli effetti del BAI sulla risposta infiammatoria locale nel DN.In primo luogo, l'infiltrazione di cellule infiammatorie è stata rilevata utilizzando la colorazione immunoistochimica.Secondo la Figura 5A, era evidente che nel modello sono state osservate più cellule infiammatorie, inclusi linfociti T (positivi per CD3), cellule T helper (positivi per CD4), neutrofili (positivi per MPO) e macrofagi (positivi per CD68). gruppo, mentre poche cellule infiammatorie sono state rilevate nel gruppo di controllo.Rispetto al gruppo modello, il gruppo BAI ha mostrato una significativa riduzione delle varie infiltrazioni di cellule infiammatorie.Quindi, i livelli di mRNA delle tipiche citochine pro-infiammatorie, come IL-1β, IL-6, MCP-1 e TNFα, sono stati determinati anche mediante RT-qPCR.CKD, malattia renale cronica;DM, diabete mellito;Farmacother biomedico.J Mol Med.Nat Rev Nephrol.Segnale redox antiossidante.Oxid Med Cell Longev.Farmaco Ris.Phytother ris.Oxid Med Cell Longev.Diabete.Segnale redox antiossidante.J Etnofarmaco.Sono J Kidney Dis.Diabete.Diabete.Farmacother biomedico.Diabete.J Am Soc Nephrol.Sono J Kidney Dis.Phytother ris.Farmaco Ris.Rene int.Farmaco Ris.Farmaco Ris.Mento Med.Questo lavoro è pubblicato e concesso in licenza da Dove Medical Press Limited.I termini completi di questa licenza sono disponibili su https://www.dovepress.com/terms.php e incorporano la licenza Creative Commons Attribution - 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